1.準備工作與材料：

菌種： 選取目標微生物（細菌、酵母等常用），確保其為純培養物且處于對數生長后期（此時細胞活力強、耐受性好）。

培養基： 選擇適合該菌種的液體培養基（如LB肉湯、YPD液體培養基等）。

保護劑：無菌甘油溶液（常用終濃度15%-30%，推薦50%或60%甘油母液）。

容器：無菌凍存管，要求能耐受超低溫。

儀器耗材： 超凈工作臺、恒溫搖床/培養箱、渦旋振蕩器、無菌移液器及吸頭、冰盒、記號筆。

低溫設備：-80℃超低溫冰箱（首選）或液氮罐。

2.菌體培養與收集：

在無菌條件下，將目標菌種接種到適量（如5-10ml）液體培養基中。

置于適宜溫度下振蕩培養（或靜置培養，視菌種而定），直至達到對數生長后期（OD值監測或根據經驗判斷，通常培養過夜后）。

關鍵點： 避免培養過度進入衰亡期。

3.配制無菌甘油溶液：

通常使用50% (v/v) 或 60% (v/v) 的甘油水溶液作為母液。

將分析純甘油與蒸餾水按比例混合（如50ml甘油 + 50ml 蒸餾水配成50%甘油）。

嚴格滅菌： 將配好的甘油溶液分裝于合適容器（如帶螺帽試管），高壓蒸汽滅菌（121℃，15-20分鐘）。冷卻后備用。滅菌后務必混勻一次，防止分層。

4.菌懸液制備與混合甘油：

若使用50%甘油母液：混合比例為 1體積母液 : 2.33體積菌懸液 (即 0.3ml甘油母液 + 0.7ml菌懸液)。

若使用60%甘油母液：混合比例為 1體積母液 : 3體積菌懸液 (即 0.25ml甘油母液 + 0.75ml菌懸液)。

直接法（常用）： 離心（如4000 rpm, 10分鐘）收集菌體，棄上清。用適量（如原培養液體積的1/2）新鮮無菌培養基或無菌生理鹽水（0.85% NaCl） 重懸菌體，制成濃菌懸液。

間接法（操作更簡單）： 直接吸取適量對數后期的新鮮菌液（無需離心）。

在無菌條件下（超凈臺內操作），將培養好的菌液轉移至無菌離心管中。

根據實驗需要，可選擇：

取等體積的無菌甘油母液（50%或60%）與上述制備好的濃菌懸液或新鮮菌液在無菌凍存管中混合。

計算示例（終濃度15%甘油）：

使用渦旋振蕩器或反復吹打，確保菌體與甘油充分、均勻混合。最終混合物應呈現均一、輕微渾濁狀態。

5.分裝與標記：

菌種名稱（全稱或標準縮寫）

菌株編號（如有）

保存日期（年月日）

操作者姓名/縮寫

甘油終濃度（可選，但推薦）

將混合好的菌液-甘油懸液，分裝到預冷的無菌凍存管中。推薦體積： 0.5ml - 1.0ml（體積過小易干涸，過大冷凍/融化速度不均）。

立即、清晰、牢固地標記凍存管：

重要： 使用耐低溫、防水的記號筆或標簽紙（專用低溫標簽）。

6.預冷與冷凍：

將預冷后的凍存管迅速轉移至 -80℃超低溫冰箱 或投入 液氮氣相（液氮罐液面之上）中保存。

目的：使樣品快速通過冰晶形成最危險的溫度區域（0℃至-40℃），減少大冰晶對細胞的損傷。

將分裝標記好的凍存管置于冰盒中預冷10-15分鐘。（此步可顯著提高某些敏感菌的存活率）

快速冷凍（推薦，尤其對冷凍敏感的菌種）：

慢速冷凍（較少用）： 將凍存管放入程序降溫盒中，再將盒子整體置于-80℃冰箱。盒內異丙醇能提供約-1℃/分鐘的降溫速率。適用于極少數對快速冷凍敏感的菌株（需驗證）。

7.長期保存：

將凍存管穩定保存在 -80℃超低溫冰箱 或 液氮罐（液相或氣相） 中。-80℃保存最為常用便捷。

確保冰箱/液氮罐工作穩定，定期添加液氮或檢查設備運行狀態。

8.復蘇（簡要）：

需要使用時，從低溫環境中快速取出目標凍存管（避免在室溫停留過久導致冰晶融化損傷細胞）。

立即置于 37-42℃溫水浴 中（或根據菌種最適生長溫度調整），快速振蕩融化（通常1-2分鐘內完成）。

在無菌條件下，用移液器吸取適量融化的菌液（建議全部或大部分），接種到合適的固體或液體培養基上。

置于適宜條件下培養，檢查菌種存活情況及純度。

1.無菌操作是生命線： 整個操作過程（從菌液轉移、甘油加入、分裝到標記）必須在超凈工作臺內嚴格按照無菌操作規范進行。任何污染都將導致保存失敗或菌種不純。

2.菌齡至關重要： 務必使用對數生長后期的健康細胞。過早（活力不足）或過晚（細胞老化、自溶）都會顯著降低復蘇率。

3.甘油濃度需精確： 終濃度通常在 15%-30% 之間（常用15%-20%）。濃度過低保護不足，過高可能產生滲透壓毒性或導致玻璃態轉變溫度升高不利于保護。務必使用無菌甘油溶液，并確保混合均勻。

4.冷凍速度的選擇：快速冷凍（直接放-80℃）適用于絕大多數細菌和酵母，能有效減少冰晶損傷。僅對文獻報道或經驗證對快凍敏感的少數菌株考慮程序慢凍。

5.溫度穩定性：-80℃超低溫冰箱 是首選。避免使用普通 -20℃冰箱長期保存，此溫度下冰晶仍會緩慢生長，導致細胞損傷，保存期大大縮短（通常僅數月）。

6.避免反復凍融： 冷凍保存的菌種嚴禁反復凍融。每次復蘇后，該凍存管即應棄用。如需再次使用，應從保存的原始凍存管中取用，或復蘇后重新制備新的甘油保存管。

7.清晰準確的標記： 模糊、脫落或信息不全的標簽是實驗室事故的常見根源。使用專用低溫標簽和記號筆，確保信息完整、永久清晰。

8.安全防護：

操作液氮時必須佩戴防凍手套（如厚皮手套或專用液氮手套）和護目鏡，防止凍傷和濺射傷害。

使用-80℃冰箱存取樣品時，也建議佩戴防凍手套，避免皮膚直接接觸超低溫金屬表面。

9.復蘇操作要快速： 融化過程務必快速（溫水浴振蕩），并立即將復蘇菌種轉移至適宜培養基中，減少甘油對細胞的潛在毒性作用。

10.定期檢查與備份： 定期（如每年）復蘇檢查關鍵菌種的存活情況。對于極其重要的菌株，建議在不同設備或位置進行備份保存（如保存兩管在不同冰箱/液氮罐），以防設備故障。

11.菌種特異性： 不同微生物對冷凍保存的耐受性不同。對于特殊或珍貴的菌株，建議查閱相關文獻或進行預實驗優化甘油濃度和冷凍條件。

12.凍存管質量： 確保使用高質量、密封良好、耐超低溫的凍存管。劣質凍存管在低溫下易破裂或密封失效，導致樣品污染或干涸。

總結

甘油菌種冷凍保存法是一種高效可靠的微生物長期保藏技術。其成功的關鍵在于嚴格的無菌操作、使用對數期健康菌體、精確配制無菌甘油溶液、確保充分混勻、采用合適的冷凍速度（通常快速冷凍）、穩定保存在-80℃或更低溫度、清晰的標記以及避免反復凍融。熟練掌握操作步驟并嚴格遵守注意事項，能最大程度地保證微生物菌種的活力、純度和遺傳穩定性，為科研、教學和產業應用提供寶貴的生物資源庫。在操作中務必時刻牢記生物安全規范和個人防護，確保實驗過程安全順利。