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PCR實驗中的核酸提取方法(下)

放大字體  縮小字體 發布日期:2025-11-21  來源:網絡
核心提示:三、堿變性法: 取血清20ul,加入1mol/L NaOH 20ul,37℃30min,離心,加 1mol/L HCl 20ul,離心后,取上清5ul,用于PCR擴增
三、堿變性法: 取血清20ul,加入1mol/L NaOH 20ul,37℃30min,離心,加 1mol/L HCl 20ul,離心后,取上清5ul,用于PCR擴增。*亦有用10ul血清加NaOH至 0.2mol/L,37℃1h,再加HCL中和離心后取上清10ul做PCR,其特異性和敏感性較前法 更好。

四、煮沸法: 經離心洗滌過的組織細胞,分泌物及血液標本,加適量無菌蒸餾水或PBS,混勻 后,100℃煮沸10~15min,14000r/min 10min,取上清做PCR.

五、碘化鈉法: 取組織細胞及抗凝血液10~100ul,加等體積的6MNaI,反復輕混 20s,加等體積:(49:1)振勻后,離心取上清加0.6體積的異丙醇,混勻后 置室溫3min.14000r/min 10min,沉淀加10~100ul,TE溶解,取5~10ul做PCR,亦有 用100ul血清加裂解液300ul(6M NaI,0.5%十二烷基肌酸鈉,10ug糖原,26mmol/L pH8.0 Tris-HCL,13mmol/LEDTA)混勻后,60℃15min,加等體積異丙醇,離心沉定 后,加TE液用于PCR擴增,其產量和質量較高。

六、異硫氰酸胍法

此法主要用于RNA的提取。標本為組織細胞及血清等。

1、異硫氰酸胍消化液

異硫氰酸胍4mol/L

檸檬酸鈉(PH7.0)25mmol/L

十二烷基肌酸鈉0.5%

β-巰基乙醇0.1mol/L

2、消化方法: 用50~100ul細胞懸液及血清,加等體積的異硫氰酸胍消化液振混勻 后,或65℃1小時,或室溫放置數分鐘,然后加1/10體積的3mmol/L pH5.2的醋酸鈉緩 沖液,再加等體積的酚:,用力振搖約10s,10000r/min,離心5min,取上清加等 體積異丙醇-20℃放置3h后,14000r/min離心15min,沉定用75%冰冷乙醇離心洗滌1~ 2次,真空干燥,沉淀用TE緩沖液溶解即可用于逆轉錄PCR擴增,或放-20℃保存。

其它消化處理標本提模板核酸的方法有①異硫氰酸胍一二氧化硅法②異硫氰酸胍-玻璃粉法。③Chelex-100法。④全血直接擴增法⑤尿素消化裂解法。各有千秋,可根據情況選用。 
編輯:songjiajie2010

 
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