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PCR反應(yīng)的關(guān)鍵因素主要有引物的選擇與設(shè)計，酶的質(zhì)量。模板的制備，在前二者都穩(wěn)定可行的情況下，PCR模板的制備尤為重要。模板處理方法的選擇及操作人員的基 本技能，決定分離模板核酸(DNA或RNA)的質(zhì)和量及PCR的成敗。而提高模板核酸質(zhì)量的 關(guān)鍵是除去雜質(zhì)(蛋白質(zhì)、酶、脂肪等)。除去抑制Taq DNA聚合酶活性抑制因子，提高模板核酸的產(chǎn)量。
傳統(tǒng)的核酸模板提取方法是采用去垢劑如SDS等來破壞細(xì)胞組份，溶解細(xì)胞膜，使蛋白質(zhì)變性，再用蛋白酶K來消化去除蛋白質(zhì)，尤其是與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)，再用酚:抽提，然后用乙醇或異丙醇沉淀核酸，供PCR實驗用。但近幾年來也發(fā)展了些 簡便實用較為有效的標(biāo)本消化處理方法。亦可滿足PCR實驗的要求。采用哪種方法消化 處理標(biāo)本，視PCR實驗的目的(是科研還是檢測)及環(huán)境條件而定。
模板核酸的提取制備方法:
一、蛋白酶K消化裂解法：適用于所有標(biāo)本的消化處理，尤以DNA樣品為佳。如組 織細(xì)胞(包括石蠟包埋組織)絨毛、毛發(fā)、精斑、血液(血清、血漿、全血)局部分泌 物、尿，糞便等。
1、試劑配制
1）蛋白酶K消化液:10mmol/L Tris.cl(PH8.0)
10mmol/LEDTA
150mmol/LNaCL
0.5%SDS
100～200ug/ml蛋白酶K.
2）蛋白酶K最好用水配成20mg/ml，臨用時加入消化液中。
2、提取方法:
有些標(biāo)本、在用蛋白酶K消化前，還需預(yù)處理一下，如糞便、分泌物、痰液、組 織塊、石蠟包埋組織等，其方法有離心去掉雜質(zhì)，脫蠟等。
臨床標(biāo)本或經(jīng)預(yù)處理的標(biāo)本加蛋白酶K裂解液50～100ul.混勻，55℃1～3小時， 或37℃過夜。加等體積的飽和酚抽提1～2次，再加等體積的:(49:1)抽提一 次，上清加入1/10體積的pH值5.23mmol/L醋酸鈉緩沖液，加入2.5倍體積的冰冷無水 乙醇(或加等體積的異丙醇)-20℃放置至少3h.取出后14000轉(zhuǎn)/min離心15min.小心吸 棄或倒出上清，沉淀加入75%冰冷乙醇15000r/min5min離心洗滌1～2次，特別小心的 吸棄或倒掉上清，真空或37℃溫箱或室溫干燥，加TE緩沖液20ul.溶解后，取3～8ul 用于PCR擴(kuò)增，或放-20℃保存。
蛋白酶K消化法除上述經(jīng)典處理法外，亦可在蛋白K消化處理標(biāo)本，經(jīng)離心處理 后，吸取上清經(jīng)95～97℃或煮沸10min滅活蛋白酶K后，直接作核酸模板用于PCR擴(kuò)增。 如雜質(zhì)較多，還可經(jīng)酚:抽提后，即可用于PCR反應(yīng)。此法蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)消除 *，Taq酶活性不受影響，具有良好的重復(fù)性與穩(wěn)定性。但操作繁復(fù)，技術(shù)要求高。
二、直接裂解法: 標(biāo)本(組織細(xì)胞，分泌物)加PBS或生理鹽水離心洗滌后，加消化 裂解液20～50ul(0.5%NP-40和0.5%吐溫-20)，95～98℃，15～30min以裂解病原體，裂解細(xì)胞。然后12000r/min離心5～10min，取上清20～30ul用于PCR擴(kuò)增。血清標(biāo)本可 直加等體積的消化液，加熱處理離心后PCR擴(kuò)增。亦有用5%的NP-40和1.5%2-ME做裂解 液，95℃30min消化處理，離心取上清，PCR擴(kuò)增檢測HBV DNA.
傳統(tǒng)的核酸模板提取方法是采用去垢劑如SDS等來破壞細(xì)胞組份，溶解細(xì)胞膜，使蛋白質(zhì)變性，再用蛋白酶K來消化去除蛋白質(zhì)，尤其是與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)，再用酚:抽提，然后用乙醇或異丙醇沉淀核酸，供PCR實驗用。但近幾年來也發(fā)展了些 簡便實用較為有效的標(biāo)本消化處理方法。亦可滿足PCR實驗的要求。采用哪種方法消化 處理標(biāo)本，視PCR實驗的目的(是科研還是檢測)及環(huán)境條件而定。
模板核酸的提取制備方法:
一、蛋白酶K消化裂解法：適用于所有標(biāo)本的消化處理，尤以DNA樣品為佳。如組 織細(xì)胞(包括石蠟包埋組織)絨毛、毛發(fā)、精斑、血液(血清、血漿、全血)局部分泌 物、尿，糞便等。
1、試劑配制
1）蛋白酶K消化液:10mmol/L Tris.cl(PH8.0)
10mmol/LEDTA
150mmol/LNaCL
0.5%SDS
100～200ug/ml蛋白酶K.
2）蛋白酶K最好用水配成20mg/ml，臨用時加入消化液中。
2、提取方法:
有些標(biāo)本、在用蛋白酶K消化前，還需預(yù)處理一下，如糞便、分泌物、痰液、組 織塊、石蠟包埋組織等，其方法有離心去掉雜質(zhì)，脫蠟等。
臨床標(biāo)本或經(jīng)預(yù)處理的標(biāo)本加蛋白酶K裂解液50～100ul.混勻，55℃1～3小時， 或37℃過夜。加等體積的飽和酚抽提1～2次，再加等體積的:(49:1)抽提一 次，上清加入1/10體積的pH值5.23mmol/L醋酸鈉緩沖液，加入2.5倍體積的冰冷無水 乙醇(或加等體積的異丙醇)-20℃放置至少3h.取出后14000轉(zhuǎn)/min離心15min.小心吸 棄或倒出上清，沉淀加入75%冰冷乙醇15000r/min5min離心洗滌1～2次，特別小心的 吸棄或倒掉上清，真空或37℃溫箱或室溫干燥，加TE緩沖液20ul.溶解后，取3～8ul 用于PCR擴(kuò)增，或放-20℃保存。
蛋白酶K消化法除上述經(jīng)典處理法外，亦可在蛋白K消化處理標(biāo)本，經(jīng)離心處理 后，吸取上清經(jīng)95～97℃或煮沸10min滅活蛋白酶K后，直接作核酸模板用于PCR擴(kuò)增。 如雜質(zhì)較多，還可經(jīng)酚:抽提后，即可用于PCR反應(yīng)。此法蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)消除 *，Taq酶活性不受影響，具有良好的重復(fù)性與穩(wěn)定性。但操作繁復(fù)，技術(shù)要求高。
二、直接裂解法: 標(biāo)本(組織細(xì)胞，分泌物)加PBS或生理鹽水離心洗滌后，加消化 裂解液20～50ul(0.5%NP-40和0.5%吐溫-20)，95～98℃，15～30min以裂解病原體，裂解細(xì)胞。然后12000r/min離心5～10min，取上清20～30ul用于PCR擴(kuò)增。血清標(biāo)本可 直加等體積的消化液，加熱處理離心后PCR擴(kuò)增。亦有用5%的NP-40和1.5%2-ME做裂解 液，95℃30min消化處理，離心取上清，PCR擴(kuò)增檢測HBV DNA.
