質譜儀的校準對于精確的 m/z 測量至關重要。校準的定義是“將已知精度的測量標準或儀器與另一標準或儀器進行比較，通過調整消除偏差”。本文中的校準一詞用于表示質量軸校準。其他校準（如電源電壓）不在本章討論范圍之內。質量軸校準需要在整個質量范圍內均勻分布一系列離子。校準完成后，可以在校準范圍內的任何質量范圍獲取數據。因此，在較大的質量范圍內進行校準是明智之舉。手動、半自動和自動校準要求在程序運行時以穩定的速率將校準液（校準溶液）引入質譜儀。校準溶液通過注射泵或連接到 LC 泵的注射器直接（注入）到質譜儀中。

建議至少每三個月校準一次質譜儀，并且大約每周檢查一次校準情況。校準的頻率取決于所需的質量精度。例如，在對肽和蛋白質進行精確質量測量時，應每天校準儀器。不過，小分子定量分析所需的校準頻率較低。

校準參數

質量分析儀應定期注入校準溶液進行校準。一般使用電噴霧離子源 (ESI)。該溶液產生的離子（已知精確質量）應涵蓋整個儀器的質量范圍，或至少涵蓋將用于后續分析的質量范圍。

其中校準所涉及的參數稱為校準參數。是指：其值不隨實驗類型而變化的儀器參數，例如峰寬、峰形、質量分布以及分辨率與靈敏度等。

峰寬取決于質量分辨率。在大多數小分子定性/定量應用中，1 個質量單位（即1 Da)的分辨率足以區分離子。單位分辨率的典型定義是:半峰高處的峰寬約為 0.6 至 0.8 質量單位。典型臺式 LC-MS 的離子輪廓掃描帶寬約為 1 個質量單位。

峰形和輪廓掃描。如圖 2 所示，在典型的臺式 LC-MS 中，豐度測量是以 0.10 m/z 的增量進行采集。當這些數據顯示在質譜中時，可顯示一條單線。高度和位置由輪廓掃描得出。

質量分配。使用特定的質譜校準物進行。校準物應是特性良好的參考物質。這些物質的認證和處理應記錄在案。LC-MS 定性分析始終使用參比物質，而定量分析則結合使用參比物質和實際分析物標準品作為校準物。

分辨率與靈敏度。質量分辨率是離子強度和峰寬之間的折衷。一般來說，分辨率越高，離子強度越低。

校準方法

對于市場上最新的 LC-MS 來說，軟件包中包含了一個自動程序，用于在 ESI 模式下進行調整和校準。不過，較舊的儀器和/或非常特殊的應用仍需要手動或半自動程序來優化影響離子檢測的參數。在 LC-MS 儀器中，質譜儀的校準分為三個步驟：

離子源和傳輸優化

質譜校準

微調（最大限度地檢測一個或多個特定離子）。

離子源和傳輸優化。在這一步驟中，以 5 μL/min 左右的穩定速率注入校準溶液，持續數分鐘，從而在 ESI 模式下對質譜儀的一個或多個特定離子進行大致調整。引入校準溶液化合物的最佳方法是使用大容量萊茵進樣環（50 或 100 μL）或注射泵（如漢密爾頓注射泵）：使用大容量注射回路時，溶劑輸送系統應設置為以5μL/min 左右的速度將 50 : 50 的乙腈/水或 50 : 50 的甲醇/水通過注射器注入離子源。注射 50 μL 校準溶液將持續至少 10 分鐘。使用輸液泵時，應將校準溶液注入注射泵，然后用熔融石英管或 peek 管連接至 ESI 噴針。

選擇用于優化的離子應位于校準范圍的中間或特定的相關區域（例如，咖啡因的 m/z = 195 或 PPG 校準溶液的 m/z = 906.7）。在使用自動調整程序來證明進入質譜儀的離子傳輸達到最佳狀態之前，應手動調整 ESI 源噴霧器，以建立進入質譜儀的穩定離子噴霧，并確保檢測到足夠的離子來校準質譜儀。

調整程度因型號而異，并取決于源的幾何形狀。一般來說，噴霧偏離入口軸線的離子源（如正交噴霧和 Z 向噴霧）需要的調整較少。對于同軸噴霧源，為避免污染儀器光學元件，必須檢查噴霧源是否直接噴射到儀器孔口。軸上離子源通常有一個側窗，可以很好地觀察噴射軌跡。在這兩種情況下，噴霧器都應始終小幅度移動，直到達到所關注離子的最高信噪比的最佳位置。離子源參數（如霧化器氣體、透鏡電壓）可自動、半自動或手動優化。

質譜校準。第二步，使用校準溶液校準 ESI 模式下的質譜儀。所有質量分析儀都必須校準。例如，三重四極桿質譜儀 (QQQ) 的 Q1 和 Q3 都要進行校準。以下是校準過程：

01

獲取校準溶液的質譜圖（校準文件），并與存儲在參考文件中的校準溶液質譜峰預期質量表進行比對。

02

將參照文件中的每個質譜峰與校準文件中的相應質譜峰進行匹配。

03

校準文件中相應的匹配質譜峰即為校準點。

04

通過校準點擬合校準曲線。

05

計算每個校準點與曲線的垂直距離。該距離代表校準后的殘差。同時計算殘差的標準偏差。這個數字是校準精度的最佳單一指標。

06

同時計算殘差的標準偏差。這個數字是校準精度的最佳單一指標。

自動校準

在開始自動校準之前，需要設置一些峰值匹配參數。這些參數決定了獲取的數據必須在哪個范圍內，軟件才能識別校準質量并成功校準。這些參數包括：

01

質譜峰搜索范圍。這是校準軟件用于搜索最強質譜峰的窗口。增大該窗口會增加質譜峰匹配錯誤的幾率。必須確保在質譜峰搜索范圍內找到正確的質譜峰；否則，校準可能會出現偏差。如果定位到不正確的峰，則應調整搜索質譜峰范圍，以便只定位到正確的離子。

02

質譜峰閾值。校準程序中將不使用所獲質譜中低于強度閾值（通常以質譜中最強峰的百分比來衡量）的所有峰。

03

質譜峰最大標準偏差或預測質量與實際質量之間的最大差值。在校準過程中，每對匹配峰都會測量獲取的校準文件中的測量質量與參考文件中的真實質量之間的差值。如果該值超過設定值，校準將失敗。降低標準偏差值可獲得更嚴格的限制，而增加標準偏差則意味著更容易滿足要求，但這可能會導致質譜峰匹配不正確。

04

峰寬。這是一個用于設置分辨率的指標，通常規定為最大強度的 50%。

如果獲取的質譜圖與參考質譜圖相似，且所有預期質譜峰都通過了上述標準，則校準可以接受。如果儀器以前從未校準過或以前的校準文件丟失，則必須使用更詳細的校準程序。該校準程序要求從最低質量離子開始定位已知質譜峰。找到質譜峰后，將為離子的精確質量分配一個數模轉換值。

一旦對儀器進行了全面校準，下次使用儀器時并不一定需要重復全面校準過程。可以通過注入校準溶液并將所有質譜峰匹配參數設置為全面校準時使用的值來執行校準驗證，而不是全面校準。如果預測質量和實際質量之間的差異不大，則原始質量校準曲線仍然有效。無論儀器型號/品牌如何，在自動校準結束時都可以獲得一份最終報告，其中顯示校準溶液的預測精確質量、質譜中每個峰的實際質量、這兩個質量之間的差值（校準精度），在許多情況下還會顯示實驗中指定的所有離子的強度和峰寬。

微調。第三步，對一個或多個特定離子的檢測進行優化，以便在 ESI 或 APCI 模式下，利用相關分析物的標準（如果有的話）對質譜進行調諧。可以選擇相關分析物的質量電荷比，或者在沒有分析物標準的情況下，選擇校準溶液中最接近相關離子質量電荷比的離子。